操作方法：以 6 孔板轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞為例
（初次使用 PEI 進(jìn)行不同基因轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)先做預(yù)試，優(yōu)化出適合自己實(shí)驗(yàn)的最 佳 PEI 和 DNA 的比例。）

轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備：

1. 轉(zhuǎn)染前一天:用膠原酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)(不建議用胰酶)。按照每孔2x106的細(xì)胞量接種 293T至6孔板(每孔加入2ml新鮮的 DMEM:F12+5%FBS wan全培養(yǎng)基和1ml的細(xì)胞懸液)置于 37°C，5%C02，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。

2. 24h后，移除之前培養(yǎng)基，每孔加入2ml 新鮮的 DMEM:F12+5%FBS。
注意:確保 293T 細(xì)胞生長狀態(tài)良好傳代不超過 15 代。

轉(zhuǎn)染流程：
1. 第一天: 顯微鏡下檢查細(xì)胞匯合度，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 70%到 80%的匯合度時(shí)，開始準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。
2. 對于每孔細(xì)胞，用 100μL無血清培養(yǎng)基（如 OPTI-MEMI培養(yǎng)基）稀釋 DNA 使 DNA 終濃度為 1ug/ml（DNA/總培養(yǎng)體積）。

3. 對于每孔細(xì)胞，用 100μL無血清培養(yǎng)基(如 OPTI-MEM I培養(yǎng)基)稀釋適當(dāng)比例的適量24765-1。DNA:PEI的比例要依據(jù)自己實(shí)驗(yàn)摸索最適比例。
4. 將稀釋的 24765-1轉(zhuǎn)染試劑加入到稀釋的質(zhì)粒中(總體積 200μL)輕輕混勻，室溫孵育 30 分鐘。

4. 小心地將 PEI-DNA 復(fù)合物滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板每個(gè)孔中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻。注意加入混合液時(shí)輕輕沿著孔板邊緣滴入，而不是在細(xì)胞的頂部以免破壞細(xì)胞的粘附性。
6. 將培養(yǎng)板放入 37°C，5%C02,培養(yǎng)箱培養(yǎng)中培養(yǎng) 24h。

觀察結(jié)果：
第二天，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，通常超過 80%的 293T 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后的 24h可以觀察到綠色熒光。

注意：
√ 建議進(jìn)行不同基因轉(zhuǎn)染時(shí)應(yīng)對 PEI 和 DNA 的比例進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最適比例，通常 篩選范圍在 1:1 到 5:1 之間。

√ 通常情況下，分別準(zhǔn)備 PEI 和 DNA 轉(zhuǎn)染溶液時(shí)其體積一般是轉(zhuǎn)染前每孔細(xì)胞培養(yǎng)液 體積總量的 1/10-1/20，如細(xì)胞培養(yǎng)液體積為 3ml，則稀釋 PEI 及 DNA 的體積為 150ul 。質(zhì)粒 DNA 的濃度通常為 1ug/ml（DNA 質(zhì)量/細(xì)胞培養(yǎng)總體積）。

√ 不同質(zhì)粒種類以及大小會影響轉(zhuǎn)染效率，如較大片段插入質(zhì)粒可能轉(zhuǎn)染效率低，可根據(jù) 實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整，如適當(dāng)增加轉(zhuǎn)染質(zhì)?？偭康取?/span>

√ HEK293 GnTI 細(xì)胞重懸浮可用槍頭或移液管反復(fù)吹打，但 CHO-S 細(xì)胞的粘附性比較強(qiáng)，重懸浮時(shí)需要借助細(xì)胞刮刀。

√ 一般建議用膠原酶消化細(xì)胞，如果表達(dá)的是膜蛋白，胰酶消化細(xì)胞可能會降低蛋白表達(dá)， 建議用膠原酶消化細(xì)胞。
√ 對于貼壁性低的細(xì)胞系，可用明膠或鼠尾膠鋪板，增加細(xì)胞與培養(yǎng)皿之間的粘附性。

√ 一旦確定了細(xì)胞類型、培養(yǎng)基和 PEI 與 DNA 的最佳比例，就可以在轉(zhuǎn)染后 24 至 96 小時(shí)內(nèi)多次觀察轉(zhuǎn)染效率，以優(yōu)化最大表達(dá)量時(shí)間點(diǎn)。

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