HEK293 細(xì)胞殘留DNA片段分析檢測(cè)試劑盒 (qPCR-熒光探針法)說明書

貨號(hào)：HG-HF002

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

本試劑盒是用于定量檢測(cè)各種生物制品的中間品、半成品及成品中 HEK293 細(xì)胞 DNA 殘留片段大小分布的專用試劑盒。
本試劑盒利用 PCR 熒光探針法原理，定量檢測(cè)樣本中 HEK293 細(xì)胞 DNA 殘留片段大小分布，本試劑盒設(shè)計(jì)三種不同的擴(kuò)增片段（99bp、200bp、307bp），用 HEK293 細(xì)胞 DNA 定量參考品分別對(duì)不同的擴(kuò)增片段制作標(biāo)曲，通過不同大小片段的比值分析樣本中 HEK293 細(xì)胞殘留 DNA 的片段分布情況。

規(guī)格：

3 × 100 Reactions

產(chǎn)品組成：

產(chǎn)品儲(chǔ)存條件與有限期：

-20℃儲(chǔ)存，有效期 18 個(gè)月。

適用機(jī)型（包括但不限于）：

◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480
配合不同機(jī)型使用時(shí)，請(qǐng)注意選擇適配的參比染料 ROX

需要準(zhǔn)備材料：

◆ 1.5mL 或 2mL 無菌低吸附離心管
◆ 離心機(jī)
◆ 熒光定量 PCR 儀
◆ 與 PCR 儀適配的 96 孔 qPCR 板或八聯(lián)排管
◆ 震蕩器
◆ 1000μL，200μL，10μL 無菌低吸附帶濾芯槍頭
◆ 各規(guī)格移液器（如 1000μL，200μL，10μL，2.5μL 等）

操作步驟：

一、HEK293 DNA 定量參考品的稀釋和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用試劑盒中提供的 DNA 稀釋液將 HEK293 DNA 定量參考品（濃度為 3ng/μL）進(jìn)行梯度稀釋，稀釋濃度依次為 3 × 10⁵fg/μL、3 × 10⁴fg/μL、3 ×10³fg/μL、 3 ×10²fg/μL，3 × 10¹ fg/μL。具體操作如下：
1. 將試劑盒中 Human DNA 定量參考品和 DNA 稀釋液置于冰上，待完i全融化后，輕微振蕩混勻，短暫離心將液體甩至管底。
2. 取 5 支干凈的 1.5mL 離心管，分別標(biāo)記為 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。
3. 在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分別加入 180μL DNA 稀釋液。
4. 按表 2 依次進(jìn)行 5 次稀釋操作，每次稀釋后確保充分混勻后再進(jìn)行下一個(gè)梯度的稀釋。如先取 20μL Human DNA 定量參考品加入步驟 3 準(zhǔn)備好的 ST1 管中，輕微振蕩充分混勻，短暫離心將液體甩至管底；然后再取 20μL ST1 中的標(biāo)準(zhǔn)品加入步驟 3準(zhǔn)備好的 ST2 管中……依次稀釋。

表 2. 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋過程

二、陰性質(zhì)控 NCS 及 NTC 的準(zhǔn)備

取 100μL DNA 稀釋液加入 1.5mL 干凈的離心管中，標(biāo)記為陰性質(zhì)控 NCS。
陰性質(zhì)控 NCS 可和同批待測(cè)樣本一起進(jìn)行樣本前處理，制備成陰性質(zhì)控 NCS 純化液。
qPCR 反應(yīng)加樣時(shí)，加入 10μL DNA 稀釋液即為陰性對(duì)照 NTC。
注：為了滿足同步進(jìn)行三個(gè)不同擴(kuò)增長(zhǎng)度的片段分析檢測(cè)需求，樣本前處理中 DNA 洗脫體積需要≥ 100μL。

三、加標(biāo)體系制備

加標(biāo)回收 ERC：建議 90uL 樣品 +10uLST3，也可根據(jù)實(shí)際情況按照其他方式制備。
加標(biāo)回收率計(jì)算：ERC 回收率在 50%~150% 之間（加標(biāo)回收率 =ERC/(0.9* 樣品 +0.1*ST3）

四、qPCR 反應(yīng)液的制備

1. 從冰箱里取出各試劑置于冰上。
2. 根據(jù)所要檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣本數(shù)量，計(jì)算所需反應(yīng)孔數(shù)，一般做 3 個(gè)重復(fù)孔 / 樣。即反應(yīng)孔數(shù) =（5 個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線 + 1 個(gè)無模板對(duì)照 NTC+ 1 個(gè)陰性質(zhì)控 NCS + 待測(cè)樣本數(shù)量）×3。
3. 根據(jù)反應(yīng)孔數(shù)計(jì)算本次所需的 qPCR 反應(yīng)液總量： qPCR 反應(yīng)液 =（反應(yīng)孔數(shù) +2）× 20μL（含有 2 孔的損失量）。
4. 待各試劑放在冰上充分融化后，參考表 3、4、5 所示并組合反應(yīng)孔數(shù)準(zhǔn)備對(duì)應(yīng)擴(kuò)增片段的 qPCR 反應(yīng)液，并充分混勻。

表 3. 99bp qPCR 反應(yīng)液配制表

表 4. 200bp qPCR 反應(yīng)液配制表

表 5. 307bp qPCR 反應(yīng)液配制表

* 請(qǐng)對(duì)應(yīng)機(jī)型選擇適配的 ROX；若機(jī)型適配為 no ROX，請(qǐng)加入等體積的去離子水（要求無核酸及核酸酶污染級(jí)去離子水）。

五、上樣

1. 將配制的各 qPCR 反應(yīng)液輕微振蕩混勻，短暫離心將液體甩至管底。按 20μL/ 孔加入排版設(shè)計(jì)（如表 9 示例或按個(gè)人設(shè)計(jì)調(diào)整）對(duì)應(yīng)的孔中，選擇對(duì)應(yīng)擴(kuò)增片段參考表 6、7、8 所示加樣，加樣后每孔總體積 30μL。

表 6. 99bp 各反應(yīng)孔加樣示例

表 7. 200bp 各反應(yīng)孔加樣示例

表 8. 307bp 各反應(yīng)孔加樣示例

表 9 96 孔板排版示例

& 該示例表示的是檢測(cè) 5 個(gè)濃度梯度的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)曲線、1 個(gè)無模板對(duì) NTC、1 個(gè)陰性質(zhì)控 NCS、3 個(gè)待測(cè)樣本。每個(gè)檢測(cè)做 3 個(gè)重復(fù)孔。也可根據(jù)自己的使用習(xí)慣進(jìn)行設(shè)計(jì)排版。

2. 將 96 孔板用光學(xué)膜封閉，輕微震蕩混勻，用 96 孔板專用離心機(jī)短暫離心裝液體全部甩至管底后放入 qPCR 儀中。

六、上機(jī)

以 ABI 公司 7500 qPCR 儀，軟件版本 V2.0.6 為例。
1. 創(chuàng)建空白新程序，選擇絕對(duì)定量檢測(cè)模板，taqman 探針法。
2. 三組 qPCR 反應(yīng)液創(chuàng)建新檢測(cè)探針，分別命名為 99bp、200bp、307bp，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為 FAM，猝滅熒光基團(tuán)為 none；創(chuàng)建新檢測(cè)探針，命名為 IPC，選擇報(bào)告熒光基團(tuán)為 VIC，猝滅熒光基團(tuán)為 none，檢測(cè)參比熒光為 ROX。
3. 將板上標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的孔選擇為 Standard，分別賦值為 3 x 10⁵、3 x 10⁴、3 x 10³、 3 x 10²，3 x 10¹ （單位為 fg/μL），并且在相應(yīng)的 Sample Name 一欄中命名為 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5；NTC 選擇 Negative Control，NCS 和待測(cè)樣品孔選擇為 Unknow，并且在相應(yīng)的 Sample Name 一欄中命名為 NTC、NCS、S1、S2、S3。
4. 設(shè)置三步法反應(yīng)程序：95℃ 5min；95℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 1 min，45 個(gè)循環(huán)；反應(yīng)體積 30μL。
5. 運(yùn)行 PCR 程序。

七、qPCR 結(jié)果分析

1. 在 Results 的 Amplification Plot 中，可初步查看擴(kuò)增曲線的形態(tài)是否正常。機(jī)器通常會(huì)自動(dòng)設(shè)置閾值（Threshold）和基線（Baseline），當(dāng) target 設(shè)置等不同時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)多個(gè)閾值，而導(dǎo)致結(jié)果分析有誤，此時(shí)請(qǐng)手動(dòng)設(shè)置閾值線，但需確保設(shè)置的閾值線在指數(shù)擴(kuò)增區(qū)，如通常 Threshold 設(shè)置為 0.15，選擇 Auto Baseline，點(diǎn)擊 Analyze，可看到調(diào)整后的結(jié)果。
2. 數(shù)據(jù)可靠性分析：
• 三個(gè)平行孔間 Ct 值差應(yīng)小于 1.0，Ct 值大于 35 的孔除外；
• 陰性對(duì)照 NTC 和 NCS 的 CT 值都應(yīng)大于標(biāo)曲最i低濃度的 CT 值或根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身驗(yàn)證結(jié)果設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)；
• 標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù) R2 ≥ 0.98，擴(kuò)增效率 85%~110% 之間；
• ERC 回收率在 50%~150% 之間；
3. 以 99bp 片段的待測(cè)樣本檢測(cè)值為 100%，計(jì)算 200bp 片段、307bp 片段的待測(cè)樣本百分比。