CRS 細(xì)胞因子 ELISA  檢測試劑盒說明書

貨號： HG-HC001

產(chǎn)品簡介：

本實驗采用雙抗夾心法半定量分析血清、血漿及細(xì)胞培養(yǎng)上清中人表達(dá)的CAR-T/CRS(細(xì)胞因子釋放綜合征)中分泌的細(xì)胞因子(IL2,IL6,IL10,IFN-y)。
將人IL-2、IL-6、IL-10 和 IFN-y特異性抗體預(yù)先包被在微滴板上。將混合物和樣品移入孔中，任何目標(biāo)細(xì)胞因子都被固定的特異性抗體結(jié)合。孵育和洗滌步驟結(jié)束后，每孔加入混合抗體-偶聯(lián)物孵育。洗去未結(jié)合的物質(zhì)后，將 HRP 偶聯(lián)物加入孔中孵育。 徹i底清洗孔，去除所有未結(jié)合的 HRP 偶聯(lián)物。在初始步驟中，將 TMB 底物添加到孔中，顏色根據(jù)目標(biāo)細(xì)胞因子的數(shù)量成比例發(fā)展。通過加入終止液停止顯色，并在波長450nm處測量熒光強(qiáng)度。將樣品的 OD值(450nm)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，測定樣品中 CART/CRS 細(xì)胞因子的濃度。

檢測范圍:

IL2: 15.625-500 pg/mL

IL6: 31.25-1000 pg/mL

IL10:15.625-500 pg/mL

IFN -y: 15.625-500 pg/mL

定量限:

IL2: 15.625 pg/mL

IL6: 31.25 pg/mL
IL10: 15.625 pg/mLIFN-y: 15.625 pg/mL

規(guī)格：

96T

試劑盒組成和儲存信息：

備 注:在保質(zhì)期前使用。如果按照上述方法保存，打開的試劑盒可保持活性8周。

需自行準(zhǔn)備的材料

（1）酶標(biāo)儀，可讀取 450nm 波長

（2）去離子水或蒸餾水

（3）移液器和移液器吸頭

（4）多通道移液器儲液槽

技術(shù)要點(diǎn)和注意事項

1.穿戴好防護(hù)手套、防護(hù)i服、防護(hù)眼鏡和保護(hù)面部，尤其是處理血液或體液樣本;

2.將試劑盒中的 100X 抗體偶聯(lián)混合物保存在-20°℃，其他組分儲存在 2-8°C;

3.在開始分析程序之前，攜帶所需的所有試劑和孔板條至室溫(20-25°C);

4.未使用的孔板必須儲存在密封的箔袋中，溫度為2-8°C;

5.所有試劑必須混合而不起泡，并在使用前短暫旋轉(zhuǎn)所有小瓶;

6.如果在 10X 洗滌緩沖液或稀釋緩沖液中觀察到晶體，則將其加熱至 37℃℃，直到晶體完i全溶解;
7.盡量減少洗滌步驟之間的滯后時間，以確保板在測定過程中不會變得完i全干燥;

8.使用前確保試劑完i全重構(gòu)和稀釋;

9.注意不要污染混合的顯色液。不要將混合的顯色液暴露在玻璃、箔或金屬上。如果溶液在使用前呈藍(lán)色，請勿使用;

10.所有試劑在使用前必須混合并且無氣泡;

11.在添加不同的試劑或樣品之間更換移液器吸頭;

注意:

1.不要使用溶血、黃疸或血脂標(biāo)本。

2.含有疊氮i化鈉的樣品不應(yīng)用于測定。

3.采集血清/血漿時，避免干擾白色肉質(zhì)層樣本。

4.為了獲得每個細(xì)胞因子的數(shù)據(jù)，需要>0.2 mL的樣品來完成一次檢測。建議有更大的容量，以防重復(fù)實驗。

需試劑配制

1.1X 洗滌緩沖液:將 10X 洗滌緩沖液稀釋到蒸餾水中，得到 1X 洗滌緩沖液。(例如，在 450 毫升蒸餾水中加入 50 毫升 10X 洗滌緩沖液，最終體積為 500 毫升)1X洗滌緩沖液在 2-8°℃下穩(wěn)定達(dá)4周。使用前充分混合。
2.1X 抗體稀釋緩沖液:將 10X 抗體稀釋緩沖液稀釋到蒸餾水中，得到 1X 抗體稀釋緩沖液。(例如，在 90mL 蒸餾水中加入10mL10X洗滌緩沖液，最終體積為 100mL)1X抗體稀釋緩沖液在 2-8℃下穩(wěn)定達(dá)4周。使用前充分混合。
3.1x抗體偶聯(lián)混合物:建議使用前立即配制好本試劑，配制后 20 分鐘內(nèi)使用。將 100X 抗體偶聯(lián)混合物稀釋到 1X 抗體稀釋液中，得到 1X 檢測抗體溶液。(例如:100X 抗體偶聯(lián)混合物濃縮液 12uL+稀釋緩沖液 1188uL)
4.1xHRP-鏈霉親和素溶液:建議使用前立即配制本試劑，配制后 20 分鐘內(nèi)使用。將 1000XHRP-鏈霉親和素溶液濃縮溶液稀釋到 1X抗體稀釋緩沖液中，得到 1X HRP-Streptavidin 溶液緩沖液。(例如 1000X HRP-鏈霉親和素溶液濃縮溶液 1uL+稀釋緩沖液 999uL)

5.樣品:測定前用等體積的樣品稀釋液稀釋血清和血漿樣品(1:1，稀釋系數(shù)=2)。如果最初的分析發(fā)現(xiàn)樣品中含有高于最高標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)，可以用樣品稀釋液稀釋樣品，然后重新分析樣品。為了計算濃度，必須考慮到稀釋系數(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)上清可直接測定。(建議預(yù)先檢測，確定合適的稀釋系數(shù))。

6.混合標(biāo)準(zhǔn):

A.加入 1mL 樣品稀釋液，重新配制凍干后的標(biāo)準(zhǔn)液，得到不同濃度的4種細(xì)胞因子的高濃度原液(見下表)。短暫的渦流，讓標(biāo)準(zhǔn)品靜置至少 15 分鐘，輕輕攪拌，以確保標(biāo)準(zhǔn)品完i全溶解，然后再進(jìn)行一系列稀釋。
B.定量分析時，使用上述高濃度標(biāo)準(zhǔn)液和稀釋 32 倍的低濃度標(biāo)準(zhǔn)液，最多 22 個測試樣品。如果需要更準(zhǔn)確的結(jié)果，用標(biāo)準(zhǔn)/樣品稀釋液緩沖液進(jìn)行兩倍連續(xù)稀釋可以產(chǎn)生更準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線。但是，測試樣本的數(shù)量將會減少。
4 種細(xì)胞因子在不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)液中的濃度如下：

試驗過程

所有材料在使用前應(yīng)平衡至室溫(RT,20-25°C)。

1.向包被酶標(biāo)板中加入 100uL 標(biāo)準(zhǔn)品混合物或稀釋后的樣品。注:為了得到4種細(xì)胞因子在 22 個測試樣品上的近似濃度，可以按以下方案加入低濃度標(biāo)準(zhǔn)混合物(S1，高濃度混合物 1:32)、高濃度標(biāo)準(zhǔn)混合物(S2)和測試樣品(T1至 T22):

2.用封板膜封板后，室溫(18~25°C)孵育2小時。

3.棄去各孔內(nèi)液體，用 1x 洗滌液注滿微孔(300 uL/孔)，靜置 30 秒后棄去孔內(nèi)液體;重復(fù)4 次，每一次洗板完成后在濾紙上拍干。

4.每孔加入 100uL的 1X 抗體偶聯(lián)混合物。

5.用封板膜封板后,室溫(18~25°C)孵育1小時。

6.洗板，同步驟 3。

7.每孔加入 100 μL 的 1000XHRP-鏈霉親和素溶液。用封板膜封板后，室溫(18~25℃C)孵育1小時。

8.洗板 7次，同步驟 3。

9.每孔加 100 μL 顯色液。用封板膜封板后，在室溫(18~25°℃)下黑暗中孵育 10-20 分鐘。

10.立即在每孔中加入 100uL終止液，輕拍平板使其混合均勻。溶液的顏色應(yīng)由藍(lán)色變?yōu)辄S色):

11.立即用微孔板讀取儀在 450nm 處讀取外徑。建議在加入終止液后 30 分鐘內(nèi)讀取吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線

結(jié)果處理

1.計算每組標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的平均吸光度值。

2.在半定量分析中，從高濃度標(biāo)準(zhǔn)液和低濃度標(biāo)準(zhǔn)液的 OD 讀數(shù)可以得到4種細(xì)胞因子的4條粗曲線。細(xì)胞因子的近似濃度可由粗曲線得到。由于標(biāo)準(zhǔn)曲線可能不是完i全筆直的，由兩個點(diǎn)得到的粗糙曲線得到的濃度可能不是很準(zhǔn)確。
3.為了獲得更準(zhǔn)確的結(jié)果，在生成標(biāo)準(zhǔn)曲線時可以使用更多的稀釋點(diǎn)。4參數(shù)物流是結(jié)果計算的首i選方法。其他數(shù)據(jù)約簡函數(shù)可能會給出略有不同的結(jié)果。

4.如果樣品已被稀釋，則必須根據(jù)樣品制備程序，用適當(dāng)?shù)南♂屜禂?shù)進(jìn)一步轉(zhuǎn)換從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取的濃度。

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